Como analisar eletroforese

Escrito por john brennan | Traduzido por ikaro mendes
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Como analisar eletroforese
Sempre que fizer seu gel, analise (Jupiterimages/Comstock/Getty Images)

Na eletroforese em gel, amostras de DNA e proteínas são separadas, de acordo com o peso, através da aplicação de um campo eléctrico, que faz com que as amostras migrem pelo gel. O uso desta técnica é rotineiro em laboratórios de pesquisas biomédicas e é usado também para responder a uma variedade de questões diferentes, logo não há uma única forma de analisar os resultados. Diferentes técnicas como Western, Northern e Southern, por exemplo, envolvem a eletroforese em gel. Se você estiver fazendo eletroforese em gel de agarose de amostras de DNA, o tipo mais comum de procedimento, você precisa fazer duas coisas: 1) distinguir plasmídeos sem cortes de inserções, plasmídeos cortados e plasmídeos de corte e 2) estimar o tamanho dos vários fragmentos de DNA. Aqui está como ele funciona.

Nível de dificuldade:
Moderadamente desafiante

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O que você precisa?

  • Imagem do seu gel (tirada com luz UV, o que torna visíveis as bandas coradas com brometo de etídio)
  • Excel ou outro programa de gráficos
  • Régua

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Instruções

  1. 1

    Verifique seu caderno de laboratório para determinar o posicionamento correto de cada amostra nos respectivos poços. Quando você for encher os poços no gel, você deve anotar onde inseriu cada amostra.

  2. 2

    Determine qual faixa contém a "escada" de padrões de DNA. Estas bandas são de tamanho conhecido, seus posicionamentos migratórios podem ser usados para determinar o peso das amostras testadas.

  3. 3

    Usando uma régua, meça a distância, na sua imagem, dos poços às bandas coradas seguintes, que terão percorrido mais do que qualquer uma das bandas de DNA (em outras palavras, será na parte inferior do gel). Anote este número -- as unidades usadas não são importantes.

  4. 4

    Meça a distância dos poços na imagem para cada uma das bandas na "escada", depois divida esta distância pela distância percorrida por canda banda corada. Este cálculo lhe dará a mobilidade relativa de cada banda. Exemplo: Suponhamos que uma banda corada caminhe 15 centímetros e temos três bandas que caminharam 12, 11 e 9 centímetros, respectivamente. Qual é a sua mobilidade relativa? Resposta: Nós dividimos 12, 11 e 9 por 15 para obtermos as mobilidades relativas de 0,833, 0,75 e 0,5833.

  5. 5

    Introduza as mobilidades relativas em seu programa de planilha eletrônica (Excel ou qualquer outro programa similar que você use), juntamente com o tamanho em kilodalton de cada banda na escada. (O fabricante fornece o tamanho de cada banda padrão, por isso você já deve ter esta informação.)

  6. 6

    Coloque no gráfico os dados de mobilidade relativa no x e tamanho em kilodaltons no y.

  7. 7

    Use a função Trendline (Tendência) em seu programa de planilha para ajustar os dados à equação. Esta deve ser uma equação de força (por exemplo x ^ -2) e deve ajustar os dados relativamente bem (R-coeficiente de pelo menos 0,9).

  8. 8

    Olhe para as bandas correspondentes às suas amostras. Lembre-se que os fragmentos de DNA menores viajam mais longe através do gel que grandes fragmentos de DNA, de modo que aqueles mais próximos das bandas de comparação será o menor. Note, no entanto, que se o DNA plasmídeo (circular), é sem cortes, ele se tornará "super-enrolado" ou torcido como um fio de telefone, o que vai realmente fazer com que viaje mais longe do que o DNA linear do mesmo tamanho. Do mesmo modo, um plasmídeo "cortado" incompleto irá percorrer uma distância menor do que o DNA linear do mesmo tamanho. Conseqüentemente, não será possível estimar o tamanho de plasmídeos sem cortes a partir do seu gel.

  9. 9

    Compare as bandas de cada poço com as amostras de comparação e determine se o resultado obtido era o esperado. Isto irá depender da natureza da sua experiência. Em geral, no entanto, se você inserir um plasmídeo digerido com duas enzimas de restrição, você esperaria que a inserção fosse libertada do plasmídeo, uma vez que é muito menor do que o plasmídeo, você esperaria ver duas bandas em que pista, uma perto do topo e a outra para baixo, perto do fundo. Um plasmídeo cortado com uma única enzima de restrição deverá formar apenas uma única banda que se desloca um pouco mais longe do que o corte do plasmídeo com duas enzimas de restrição, mas nem tão longe quanto à inserção.

  10. 10

    Meça a distância entre os poços do plasmídeo cortado e das bandas de inserção, com a sua régua. Divida estes números pela distância percorrida pelo corante de rastreamento para encontrar a mobilidade relativa dos plasmídeos de corte e inserção.

  11. 11

    Insira a mobilidade relativa das inserções e dos plasmídeos cortados na equação em seu programa de planilha calculada por você. Este cálculo deve dar-lhe uma estimativa do tamanho destes plasmídeos.

Dicas & Advertências

  • Se visualizar bandas brilhantes e largas na parte inferior de cada linha simples, você provavelmente tem algumas amostras de RNA em seu gel -- o que significa que o protocolo de purificação pode ter falhado.

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