Como calcular a carga viral

Escrito por ethan schwartz | Traduzido por angela spada
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Como calcular a carga viral
Pode-se usar contagens em placa de cultura para calcular a carga viral (Bacteria Colonies image by ggw from Fotolia.com)

"Cálculo da carga viral" é uma maneira complicada de dizer que um cientista está contando a quantidade de vírus em uma determinada amostra. Para tanto, os cientistas infectam placas de cultura com soluções contendo vírus em várias concentrações e calculam a quantidade viral na solução original pela contagem das bactérias mortas pela infecção por vírus.

Nível de dificuldade:
Desafiante

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O que você precisa?

  • Luvas
  • Cultura viral
  • Caldo
  • 10 tubos de diluição
  • 10 tubos de cultura
  • 10 placas de Petri
  • Água fervente
  • Banho de água quente
  • Pipetas
  • Ágar-triptona
  • Cultura bacteriana
  • Incubadora
  • Calculadora

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Instruções

    Diluições em série

  1. 1

    Ponha as luvas, encha os tubos de cultura com 9 ml de caldo e coloque as seguintes etiquetas: “10ˉ¹,” “10ˉ²”, “10ˉ³" e assim por diante até chegar a “10ˉ¹⁰” Esses tubos serão usados para as diluições virais em série. Como os vírus podem crescer até concentrações incrivelmente altas, será necessário diluí-los para realizar uma contagem eficiente. Cada tubo representa uma diluição viral de dez vezes.

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    Separe 1 ml da cultura viral que deseja titular e transfira-a, com uma pipeta, para o tubo com a etiqueta “10ˉ¹”. Misture-a bem no tubo. Esse é o primeiro passo da diluição de dez vezes.

  3. 3

    Separe 1 ml da cultura misturada do seu tubo com a etiqueta “10ˉ¹” e transfira-a, com uma nova pipeta, para o tubo com a etiqueta “10ˉ².” Misture-a também nesse tubo.

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    Continue esse padrão para criar uma diluição em série. No final, você terá 9 tubos de 9 ml e 1 tubo de 10 ml. As cargas virais em seus tubos estarão diluídas em cerca de 10 vezes (em seu primeiro tubo) ou de 100 vezes (em seu segundo tubo) até dez bilhões de vezes (em seu tubo final).

    Preparando as placas

  1. 1

    Separe 10 tubos de ágar-triptona mole e 10 placas de Petri e aplique etiquetas de modo a corresponderem aos tubos de diluição em série.

  2. 2

    Solte as tampas para não se desprenderem com o calor e, em seguida, ponha os seus tubos de ágar em uma proveta com água fervente. Isto derreterá o ágar de modo que se possa despejá-lo nas placas de Petri.

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    Transfira seus tubos para um banho-maria quente regulado para 45ºC. Isso garantirá que o ágar não se solidifique nos tubos antes que você tenha chance de despejá-lo em uma placa de Petri.

  4. 4

    Adicione duas gotas de cultura bacteriana ao ágar e misture suavemente. Estas são as bactérias que serão mortas, permitindo que você faça a contagem do número de partículas virais em uma determinada solução.

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    Adicione 1 ml de cada diluição em série aos tubos correspondentes de ágar enquanto ainda estiverem em banho-maria quente. Por exemplo, 1 ml de sua diluição em série 10ˉ¹, ao ser passada para o tubo de ágar, deverá ter a etiqueta "10ˉ¹".

  6. 6

    Misture a solução em cada tubo e depois despeje na placa de Petri de etiqueta correspondente. Isso criará em cada placa uma fina camada do ágar que foi inoculado com bactérias e vírus. Deixe as placas crescerem por uma noite em uma incubadora.

    Contagem e cálculo dos títulos

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    Retire suas placas da incubadora e examine-as. Você deverá visualizar áreas turvas em toda a placa de Petri onde houver crescimento bacteriano com exceção de pequenas manchas brancas chamadas placas. Essas placas são manchas de bactérias mortas e cada uma representa um vírus.

  2. 2

    Descubra uma placa de Petri que possua entre 30 e 300 placas bacterianas e conte o número exato delas em cada uma.

  3. 3

    Multiplique por 10 os números obtidos nas placas bacterianas existentes na placa de Petri. Se você contar 157 placas bacterianas, obterá o número 1.570.

  4. 4

    Multiplique o número obtido na etapa anterior pelo número inverso em seu tubo de diluição. Por exemplo, se a placa de Petri selecionada tiver a etiqueta 10ˉ⁵, você deve multiplicar 1.570 por 10⁵, obtendo o número 157.000.000. Esse número final é o título viral de sua solução e representa o número de vírus por mililitro (ml) de sua cultura original.

Dicas & Advertências

  • Seja cuidadoso ao trabalhar com vírus. Nem todos são perigosos, mas deve-se tomar precauções. Troque as luvas com frequência. Limpe quaisquer espirros imediatamente e desinfete a área.

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