Como fazer clonagem de DNA utilizando a técnica de PCR

Escrito por sarah quinlan | Traduzido por mariana castañon de souza
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Como fazer clonagem de DNA utilizando a técnica de PCR
A clonagem por PCR pode envolver crescimento de culturas bacterianas que contenham o gene requerido (Bacteria Colonies image by ggw from Fotolia.com)

A clonagem de DNA, ou a tecnologia de DNA recombinante, é uma ferramenta da biologia molecular na qual um gene de interesse (gene-alvo) é isolado e transferido para um organismo auto-replicante, como bactérias com plasmídeo. O código genético do plasmídeo bacteriano replicar-se-á e vai gerar múltiplas cópias do gene desejado em quantidades suficientes para serem manipuladas e analisadas ​​para fins científicos. A clonagem de genes pode ser realizada através da utilização de plasmídeos e enzimas de restrição que irão cortar o DNA nas extremidades do gene-alvo ou, também, através da realização de um ensaio chamado 'Reação em Cadeia da Polimerase' (PCR; do inglês: 'polymerase chain reaction') que amplificará o gene desejado.

Nível de dificuldade:
Desafiante

O que você precisa?

  • Kits de clonagem comercialmente disponíveis
  • Reagentes para PCR
  • Termociclador (ou máquina de PCR / PCR machine)
  • Incubadora
  • Equipamentos de laboratório e suprimentos
  • Gene-alvo para clonagem

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Instruções

  1. 1

    Estude e familiarize-se com a técnica de PCR e protocolos de clonagem. Há uma grande quantidade de informações já conhecidas no meio científico sobre biologia molecular que você deve e precisa entender se quiser obter sucesso na sua clonagem. Muitos protocolos e kits de clonagem estão comercialmente disponíveis a partir de empresas como a Qiagen, Invitrogen, Promega, Applied Biosystems dentre outras. Assim sendo, determine o que você precisa para sua clonagem e escolha os materiais e recursos apropriados.

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    Realize uma reação de PCR em seu gene de interesse. O processo de PCR envolve ciclos de aquecimento e resfriamento para desnaturar o DNA de cadeia dupla, hibridização (ou anelamento) dos pequenos fragmentos de DNA chamados de iniciadores (ou 'primers') para marcarem as extremidades do gene de interesse e construir novas fitas complementares de DNA usando uma enzima chamada DNA polimerase. Estes passos repetem de 40 a 50 vezes, amplificando o seu DNA de cada ciclo, resultando em milhares de cópias de gene-alvo. Você precisa saber a seqüência do gene para que utilizar os iniciadores apropriados que haja uma ligação fortuita entre o iniciador e a região desejada do código que você deseja amplificar. Dependendo do seu método de clonagem - de cortes abruptos na finalização de determinados genes ("blunt-end") ou clonagem T-A (envolve ligações com timinas complementares projetadas para facilitar o corte), por exemplo - pode haver a necessidade de enzimas DNA polimerase específicas, como a Taq polimerase, polimerase razoavelmente termoestável em altas temperaturas mas que não tem, porém, capacidade de correção nucleotídica, e, desse modo, ao longo da construção das novas fitas de DNA a Taq irá amplificar o DNA sequencialmente e deixará pontas coesivas ao longo da amplificação.

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    Caso desejado, deve-se purificar os genes amplificados no PCR. Este passo pode ser feito de várias maneiras. Uma maneira possível é a filtração através de colunas de giro para retirar qualquer iniciador ou enzimas remanescentes. Ou também pode-se correr uma eletroforese para separando, cortando e lavando as bandas de DNA obtidas.

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    Ligue o gene purificado e amplificado por PCR vetor plasmídico apropriado. No kit comprado comercialmente, um vector de plasmídeo padrão, como pGEM ou pCR2.1 será fornecido. Configure sua reação de ligação de acordo com o kit ou as recomendações do fabricante em relação a quantidade necessária de DNA amplificado, de tampão de ligação, plasmídeo e enzima DNA ligase. A reação de ligação irá permitir que o plasmídeo circular introduza o seu gene no genoma do plasmídeo.

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    Realize uma reação de transformação na qual o vetor plasmídico (contendo seu gene) seja inserido em uma célula bacteriana, muitas vezes utiliza-se a E. Coli. Faça placas de ágar vários dias antes para a preparação desta etapa e mantenha as placas na incubadora. Combine o seu plasmídeo com as células com muito cuidado, adicionando os volumes de reagentes e utilizando os tempos de incubação mencionados no protocolo que você está usando. Espalhe suas células bacterianas nas placas de agar, incube a 37 graus e deixe-as durante a noite.

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    Observe nas placas de ágar as colônias de bactérias azuis e brancas. Colônias contendo o gene de inserção serão brancas, não azuis. Escolha várias colônias brancas e cultive-as em meio com caldo lisogênico(LB, em inglês: Lysogeny broth) com ampicilina para obter uma grande quantidade de bactérias com sua inserção gene clonado. Após essa etapa você terá uma grande oferta do seu gene amplificado e codificado. Para realizar a pesquisa sobre o gene clonado, use um kit disponível comercialmente para isolar o DNA plasmidial bacteriano e purifique seu gene. Guarde no freezer até que seja necessário.

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