Componentes dos tampões de lise

Escrito por john brennan | Traduzido por fabiana silva
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Componentes dos tampões de lise
Os tampões de lise decompõem as células para extrair seus conteúdos (Jupiterimages/Photos.com/Getty Images)

Lise é uma palavra grega e significa simplesmente "dividir" ou "decompor". É uma boa descrição da reação que ocorre com as células em um tampão de lise, uma solução que as decompõem para extrair seu conteúdo. Os cientistas usam essas soluções para extrair o DNA ou as proteínas nas análises de células, especialmente no caso das bactérias. O tipo de tampão de lise celular varia dependendo do tipo do experimento, contudo mencionaremos algumas escolhas comuns.

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Tampão e sal

As soluções tampão estabilizam o pH, enquanto as células passam pelo processo de lise. A solução de tris-HCL é o tampão mais comum para o tamponamento em um pH 8, caso o pH seja desejado. HEPES é outra solução tampão comum nesses experimentos. O cloreto de sódio também pode ser adicionado para aumentar a força iônica, a concentração total de solutos fora das células. Esse último é importante já que a água pode se difundir em todas as membranas da célula, de regiões de baixa concentração de soluto para as de alta concentração.

Detergente

O detergente é o principal ingrediente que dissolve a membrana celular para que o conteúdo possa sair. Os detergentes são moléculas anfipáticas, ou seja, com uma extremidade que facilmente interage com as moléculas de água enquanto a outra extremidade hidrofóbica, ou "que tem medo de água", não faz essa interação. Eles podem dissolver as gorduras ao formar micelas, pequenos grupos, nos quais as caudas hidrofóbicas das moléculas de detergente apontam para dentro, para as moléculas de gordura. Os detergentes comuns são o dodecilsulfato de sódio ou SDS, NP-40 e tritonX.

Agentes quelantes e inibidores

Os tampões de lise normalmente também contêm agentes quelantes como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou o ácido retileno glicol tetra-acético (EGTA). Essas substâncias químicas se ligam aos íons de metal com uma carga +2 (por exemplo, o magnésio e o cálcio), os tornando, dessa forma, indisponíveis para outras reações. Muitos DNAses (proteínas que mastigam o DNA) e proteases (proteínas que cortam outras proteínas) precisam de íons de magnésio para funcionarem, então, ao privá-las desse ingrediente principal, o EDTA e o EGTA, ajudam a reduzir o nível de protease ou da atividade de DNAse. Entretanto, eles não as exclui completamente e algumas protesases não dependem dos cofatores de magnésio, portanto, os tampões de lise às vezes também contêm substâncias chamadas inibidores de protease, que se ligam a ela e evitam que funcione corretamente.

Lise alcalina

A lise alcalina é uma técnica muito comum para purificar os plasmídeos das bactérias. Esse método implica no uso de três soluções. A primeira contém glicose, tampão tris-HCL, EDTA e RNAses. A glicose cria uma alta concentração de soluto fora das bactérias, de modo que elas se tornam um pouco flácidas facilitando o processo de lise. O EDTA e o tris-HCL funcionam como já descrito anteriormente, enquanto o RNAse mastigará qualquer RNA dentro da célula para tirá-la do caminho. A segunda solução faz efetivamente a lise celular. Ela contém o detergente SDS e NaOH, que eleva o pH para 12, ou acima, desnaturando as proteínas dentro da célula e fazendo com que o DNA se separe em filamentos simples. A terceira solução contém acetato de potássio para restaurar o pH para um nível mais neutro, de forma que os filamentos de DNA de plasmídeo possam se unir. Enquanto isso, as proteínas desnaturadas se reúnem e precipitam-se, enquanto os íons de dodecil sulfato se unem aos íons de potássio para formarem um composto insolúvel, que também pode se precipitar da solução.

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