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Como entender os resultados da citometria de fluxo

Atualizado em 21 fevereiro, 2017

Os cientistas usam a citometria de fluxo para diferenciar os tipos de células em organismos microscópicos. Trata-se de uma ferramenta utilizada em muitas aplicações, como diagnósticos médicos e patologia forense. Embora essa técnica experimental seja fácil de realizar, a análise dos dados complexos produzidos pela citometria de fluxo é mais difícil devido a diversos fatores experimentais e/ou parâmetros citométricos. Sendo assim, a visualização e a análise de dados citométricos são rotineiramente realizadas usando programas profissionais sofisticados, como o CELLQuest ou o FlowJo. A familiaridade com técnicas, o maquinário e o software de citometria são necessários para entender os resultados produzidos por esses experimentos.

Instruções

Os profissionais utilizam softwares para visualização e análise dos dados citométricos (Polka Dot RF/Polka Dot/Getty Images)

    Entendendo os dados da citometria de fluxo

  1. Esclareça o objetivo do experimento, perguntando "Qual é a questão ou hipótese sendo investigada?". Isso será necessário para ajustar os resultados brutos a um formato e configurações apropriados para futura análise, usando um programa de citometria estatística. Faça qualquer mudança necessária para exibir os dados com configurações relevantes (por exemplo, células positivas, gates negativos, intensidade da fluorescência, população de células etc.).

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  2. Encontre os gates. As células podem ser agrupadas ou simplesmente reunidas em um gráfico de densidade ou diagrama de contorno. Os grupos frequentemente são separados, dependendo da sua identidade. Se um grupo se destacar muito intensamente de um marcador em particular ou anticorpo, conclui-se que todos os membros desse grupo têm a identidade do tipo celular específico, que expressa aquele marcador. É comum encontrar células que são positivas para mais de um desses marcadores; elas são normalmente um intermediário e chamadas de "duplo positivo".

  3. Veja os gráficos de dispersão. A forma como as células se espalham pelo gráfico é uma indicação do tamanho delas. As células com dispersão muito grande ou alta são normalmente grandes; contudo, elas podem ser grandes simplesmente por conterem alta proporção de citoplasma ou podem ser altas porque têm núcleos muito grandes. Dependendo da biologia sendo investigada, isso, é claro, variará amplamente entre experimentos.

  4. Veja os números. Ajuste os gráficos para exibir diferentes parâmetros em um eixo (normalmente o eixo X) enquanto mantém a contagem em Y. Isso indica a proporção da população de amostra que é positiva para aquele parâmetro em particular, visto que um pico normalmente será observado em uma amostra com uma mancha positiva, o que estará ausente na amostra de controle negativa.

  5. Veja os histogramas de parâmetros múltiplos. Ajustando os eixos X e Y para que cada um represente um parâmetro diferente do que foi investigado durante o experimento, é possível obter uma compreensão mais profunda das propriedades da amostra. Por exemplo, atribuir vermelho fluorescente para o eixo X e verde fluorescente para o eixo Y, os gates do tipo quadrante podem ser calculados para que a amostra exiba quatro regiões de um quadrante no qual as células estejam presentes e em mancha vermelha, verde, as duas cores ou nenhuma. Isso permite que uma amostra heterogênea seja dividida nas suas partes componentes e quaisquer entidades sobrepostas sejam visualizadas e quantificadas.

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O que você precisa

  • FlowJo ou outro software de análise de dados citométricos
  • Dados brutos da citometria de fluxo
  • Protocolos experimentais e máquinas de citometria de fluxo

Referências

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