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Como limpar e regenerar uma coluna C8 de HPLC

Atualizado em 17 abril, 2017

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) é um método comum de análise laboratorial no qual uma amostra é separada em seus componentes químicos conforme passa através de uma coluna. Essa coluna é preenchida com um material poroso, tipicamente sílica gel. Uma coluna padrão de fase reversa, assim como a C8, algumas vezes pode entupir ou ficar contaminada. Essas colunas podem ser recuperadas usando técnicas bem simples.

Instruções

O solvente certo pode recuperar uma coluna suja (Jupiterimages/liquidlibrary/Getty Images)

    Recuperando a coluna

  1. Desacople a coluna e reverta a sua posição, de maneira que a fase móvel agora esteja entrando pelo que normalmente é a saída da coluna. Acople uma saída na outra ponta da coluna (o que era a entrada original), e deixe escorrer dentro de um descarte.

  2. Bombeie uma série de solventes em ordem de polaridade decrescente. Uma série básica recomendada é começar com metanol, então passar para a acetonitrila, então acetonitrila/isopropanol (75:25), isopropanol, cloreto de metileno e hexano. Se a fase móvel que estava na coluna era absorvente, uma passagem com água antes no metanol é recomendada. Um fluxo de um a dois mililitros por minuto é suficiente, e aproximadamente dez colunas de volume de cada solvente devem ser bombeados. A coluna de volume é o espaço interno da coluna, e é calculado por (0.7 x pi x (DI/2)^2 x L), onde DI é o diâmetro interno da coluna e L é o comprimento.

  3. Bombeie outros dez volumes de isopropanol pela coluna para prepará-la para o uso com a fase móvel original. Se a fase móvel original foi amortecida, também bombeie água pela coluna depois do isopropanol, antes de voltar para a fase móvel original.

  4. Desacople a coluna, reverta-a e acople novamente, para que fique na sua posição original (para que a fase móvel entre pelo lado certo da coluna). Reconecte a saída da coluna no detector.

Dicas

  • Se esse processo não limpar completamente a coluna, uma mistura 50:50 de dimetil sulfóxido (DMSO) e dimetil formamida (DMF) pode ser utilizada. Resíduos de proteínas e íons metálicos podem requerer outros tipos de solventes, como reagentes pareadores de íons ou uma solução de ácido tetracético de etileno diamina (EDTA).

Aviso

  • Em alguns aparelhos, a coluna terá uma peneira de metal áspera como entrada. Nesse caso, reverter a coluna permitirá que a fase estacionária saia da coluna, e isso não é recomendado. Consulte o seu vendedor se você não tiver certeza.
  • O solvente usado nesse processo é potencialmente tóxico quando ingerido e inalado. Use precauções laboratoriais normais ao manusear.

O que você precisa

  • Aparelho de HPLC
  • Água
  • Metanol
  • Acetonitrila
  • Isopropanol
  • Cloreto de metileno
  • Hexano
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