Métodos para isolamento de proteínas

Escrito por palmer owyoung | Traduzido por lucas vilaça
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Métodos para isolamento de proteínas
Proteínas são rotineira e facilmente isoladas, usando diferentes métodos estabelecidos por vários padrões biológicos e farmacêuticos (Image by Flickr.com, courtesy of Umberto Salvagnin)

Proteínas são isoladas de células ou tecidos pulverizados. Assim que a célula é quebrada, seu conteúdo, também chamado de lisado, é coletado para uma segunda purificação baseada nas propriedades da proteína, tais como tamanho, carga e afinidade de ligação específica. Apesar de existirem vários protocolos, alguns métodos dentre eles são de uso rotineiro.

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Diálise

Este método envolve a filtragem de um lisado diluído ou de uma solução de proteínas, por uma membrana permeável, para que as proteínas maiores que o diâmetro dos poros fiquem retidas e apenas as menores sejam retiradas. A diálise também pode ser usada para concentrar a solução de proteínas; no entanto, já que esse método não pode diferenciar proteínas com eficiência, é sempre seguido por técnicas mais específicas. Existem sistemas automatizados que podem realizar a diálise, e vários kits comerciais que oferecem os reagentes (soluções) necessários.

Precipitação e solubilização

Proteínas não se dissolvem (ou "solubilizam") bem em soluções com grandes concentrações de sal. Essa propriedade da solubilidade difere entre proteínas e é uma boa maneira de se distinguir entre tipos muito parecidos. A partir de uma solução de várias proteínas, quantidades crescentes de sais como o sulfato de amônia podem ser usadas para fracionar e precipitar primeiro as maiores proteínas (em quantidades menores de sulfato de amônia), e a partir disso também concentrar amostras muito diluídas. Este é o método mais usado, dada sua simplicidade.

Cromatografia

Este método inclui filtração por gel, troca de íons, afinidade e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Em todos os casos, o lisado corre por uma coluna contendo camadas porosas de características diferentes, mas específicas. A cromatografia de filtração por gel separa as proteínas pequenas das grandes, usando camadas de materiais como dextran, poliacrilamida ou agarose. A cromatografia por troca de íons separa proteínas por cargas líquidas, usando camadas que contém grupos de carboxilatos. Proteínas que se unem às camadas são retidas, enquanto aquelas com ligações fracas ou que não se ligam passam direto e são coletadas no outro lado da coluna. Também é possível recuperar as proteínas que se ligaram. Essa abordagem é usada na cromatografia por afinidades, que explora a afinidade de uma proteína com ligantes químicos específicos. A proteína ligada é removida da coluna ao se encharcar as camadas com uma solução que enfraquece as ligações. A CLAE é uma versão de maior resolução, mais rápida e eficaz da cromatografia.

Ultracentrifugação

Soluções de proteínas de diferentes massas ou densidades podem ser separadas, baseando-se no tempo em que levam para precipitarem-se ao fundo de um tubo durante a centrifugação. Partículas mais densas e/ou pesadas vão descer primeiro, enquanto as mais leves ou menos densas vão se manter dissolvidas. A separação de proteínas é realizada em uma solução contendo camadas de concentrações crescentes ou decrescentes de algum material, como a sacarose ou outro meio, como o Percoll. A ultracentrifugação nesse "gradiente de concentração" permite a separação de proteínas maiores das menores. Ambos precipitado e sobrenadante (contendo as proteínas menores) podem ser coletados para purificação ou análise posterior.

Conclusão

Bons métodos de isolamento vão render proteínas em grandes quantidades e com alto grau de purificação, e em cada caso, requerimentos de experimentação subsequentes devem ser levados em conta ao se escolher o método mais apropriado para se usar. Ótimos recursos para mais detalhes e protocolos precisos são o "Guia para Isolamento de Proteínas" (A Guide To Protein Isolation, Clive Dennison, editora Kluwer, 2003; em inglês), e "Princípios e Reações da Extração, Purificação, e Caracterização de Proteínas" (Principles And Reactions Of Protein Extraction, Purification, And Characterization, Hafiz Ahmed, editora CRC Press, 2005; em inglês). No entanto, a maioria dos protocolos e laboratórios profissionais utilizam kits desenvolvidos para comércio que consistem de passos simples e eficientes, mas mais importante que isso, para isolamento de várias classes de proteínas.

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