Como quantificar géis de eletroforese em imagens

Escrito por palmer owyoung | Traduzido por lean pereira
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A eletroforese é uma técnica essencial à clonagem genética e outros experimentos na biologia molecular avançada. Cientistas a usam de forma rotineira com apenas um objetivo — separar DNA, RNA ou proteínas em seus componentes moleculares individuais dentro de uma placa de gel. O procedimento permite a eles determinar quanto de uma molécula está presente em uma amostra e quão grandes as moléculas são. Para fazê-lo, se permite à amostra migrar por toda a extensão do gel, até que ela se divida em faixas de distintos tamanhos em diferentes pontos do gel. Finalmente, o gel contendo as moléculas migratórias é fotografado. Essa é a imagem que deverá ser quantificada para fins de análise de dados.

Nível de dificuldade:
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Instruções

    Quantificação da imagem do gel de eletroforese

  1. 1

    Escolha um software de análise de imagens adequado. Este passo é obrigatório. Por isso, o acesso a softwares de densitometria como o KODAK DirectView EVP Plus e o Carestream Molecular Imaging deve ser obtido de antemão. De forma alternativa, programas mais baratos (por ex, Adobe Photoshop) ou de código aberto feitos especificamente para a análise de imagens científicas (por ex, ImageJ) estão também disponíveis. ImageJ é um pacote gratuito e repleto de opções, comum em laboratórios de biologia molecular e também simples de ser operado. Para o propósito deste artigo, o ImageJ será usado como exemplo. Entretanto, os princípios em cada passo são universais e facilmente aplicáveis a todos os tipos de software de análise de imagens.

  2. 2

    Converta a imagem a um formato que se possa usar. O ImageJ é compatível com diversas máquinas e câmeras de imagem usadas em laboratórios de eletroforese. Entretanto, é comum praticar a criação de .JPEG, .TIFF ou outros formatos universais da imagem a ser analisada.

  3. 3

    Importe a(s) imagem(ns) ao software de análise. Alguns destes programas fazem com que as imagens importadas tenham menor resolução, modificações de contraste e outros problemas de qualidade; ainda assim, é uma boa ideia importar todos os formatos disponíveis e escolher o que tenha maior qualidade no software preferido. O ImageJ não tem o problema da resolução, e preserva toda a qualidade dos dados originais.

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    Converta a cor da imagem para "grayscale". No ImageJ, selecione a aba "Image" e, no menu, em "grayscale".

  5. 5

    Selecione os parâmetros corretos de medida para a análise. Na aba Analyse, selecione \"Set Measurements\" e clique nas caixas para \"Area\", \"Mean Gray Value\" e \"Integrated Density\" no menu que aparecerá.

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    Selecione a escala correta para a análise. No software de exemplo, clique em \"Analyze\", \"Set Scale\" e, no espaço para Unit ou Lenght, digite em \"pixels\".

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    Inverta as cores para clareza visual. Sob a aba Edit, selecione \"Invert\" para que as áreas claras se tornem escuras e vice-versa.

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    Selecione as faixas desejadas na imagem. Na paleta de ferramentas, selecione a ferramenta \"Freehand Selection\" e arraste o ponteiro do mouse pelas bordas da primeira faixa ou da faixa no experimento principal. Selecione apenas a faixa, e evite todo o sombreamento de fundo, que é essencialmente ruído.

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    Meça (isto é, quantifique) as áreas selecionadas. Pressione "m" e, na janela Results que aparece encontre as medidas para Integrated Density, Area e Mean Gray Value etc. Repita os passos anteriores até que todas as faixas tenham sido medidas. Em seguida, copie todos os valores para a planilha. As imagens quantificadas agora estão prontas para a análise de dados no programa de anotações.

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