Solução de problemas para eletroforese em gel

Escrito por douglas bintzler | Traduzido por débora faggioni
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Solução de problemas para eletroforese em gel
A eletroforese em gel é um método comum para a separação de amostras de proteínas ou DNA (Jupiterimages/Comstock/Getty Images)

Eletroforese em gel de poliacrilamida, ou PAGE, é uma técnica utilizada para a separação de moléculas orgânicas em uma amostra biológica. As moléculas com tamanho e peso menores migram mais rapidamente em gel de poliacrilamida, quando uma corrente eléctrica é aplicada. Bandas nítidas distintas são geralmente observadas após o gel concluído ser incubado em uma mancha. Esse é um método relativamente simples. No entanto, a ausência de bandas, bandas que borram ou que não são nítidas podem indicar um problema em uma ou mais etapa do método. Você deve seguir as orientações básicas, para solucionar problemas do método de eletroforese em gel em que os resultados não são os esperados.

Nível de dificuldade:
Moderadamente desafiante

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O que você precisa?

  • Grau de qualidade bis: placas de acrilamida ou placas pré-moldadas
  • Duas placas de vidro
  • Bis-acrilamida
  • Tampão TBE (Tris, ácido bórico, EDTA)
  • Fonte de energia
  • Tampão para câmara superior
  • Tampão para câmara inferior
  • Proteína de amostra de DNA
  • TEMED
  • Persulfato de amônio
  • Gel para coloração

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Instruções

  1. 1

    Comece com o passo final da eletroforese em gel e trabalhe retroativamente. Para eletroforese em gel, o passo final é o procedimento de coloração utilizado para observar bandas da amostra. Poucos problemas devem realmente ocorrer durante o processo de coloração. No entanto, o corante para manchar deve ser bem dissolvido no tampão apropriado antes de ser utilizado para corar o gel. Verifique se foi utilizada a concentração correta de corante.

  2. 2

    Verifique a fonte de energia. A ausência de bandas pode indicar que a configuração de corrente ou de tensão está demasiadamente elevada e as amostras de teste migram para fora do gel. Configurações elevadas podem também fazer com que os componentes da amostra migrem através do gel rápido demais, ocasionando baixa resolução e bandas pouco nítidas. As amostras podem não migrar através do gel, se a configuração da fonte de energia for baixa. As amostras também podem acumular-se no poço onde foram carregados e não migrar através do gel.

  3. 3

    Verifique a acrilamida líquida usada para converter o gel de poliacrilamida. Tipicamente, a porcentagem de acrilamida usada para converter um gel de poliacrilamida varia de 5% a 15%. As amostras compostas de moléculas de maiores dimensões são carregadas em um gel de 5%, porque grandes fragmentos se movem mais lentamente no gel com uma percentagem mais elevada de acrilamida. Pequenas moléculas são carregadas sobre um gel de maior percentagem, pois uma concentração baixa de gel não seria capaz de processar amostras menores.

  4. 4

    Verifique os reagentes utilizados para polimerizar a acrilamida. Um gel de poliacrilamida é formado por polimerização de uma mistura líquida, que consiste em bis-acrilamida e acrilamida. Persulfato de amônio e TEMED são adicionados à acrilamida, para catalisar a formação do gel. Tipicamente, a acrilamida deve mostrar sinais de polimerização (formação de gel) 15 minutos após o persulfato de amônio e o TEMED forem adicionados. Polimerização que ocorre muito rapidamente é o resultado de grandes quantidades de persulfato de amônio. Quando em quantidade insuficiente, pode causar a polimerização incompleta ou desigual.

  5. 5

    Confirme a quantidade das amostras carregadas. Altas concentrações de amostras podem se mover lentamente através do gel e reduzir a resolução da banda. A baixa concentração da amostra pode não ser observada após o gel ser corado. Esses corantes apresentam limitações quanto à quantidade mínima de amostra que pode ser visualizada, como resultado da sensibilidade da coloração.

  6. 6

    Confirme a qualidade das amostras carregadas. Sais e outros contaminantes presentes em uma amostra podem afetar o movimento da amostra ao longo do gel. Eletroforese é o resultado de passagem de corrente eléctrica através de um gel que contém um tampão de corrente condutora; concentrações elevadas de sais na amostra podem afetar o movimento dessa corrente através do gel. Ao isolar uma amostra, deve-se incorporar um kit de purificação, de modo a produzir uma amostra relativamente pura.

  7. 7

    Revise a literatura ou o protocolo escrito para determinar se a "PAGE" correta foi utilizada para realizar o experimento. A porcentagem de acrilamida em "PAGE" é específica para o tamanho da amostra a ser testada. A literatura também pode fornecer informações específicas com relação ao estabelecimento da fonte de energia e à taxa de migração da amostra.

Dicas & Advertências

  • As orientações fornecidas são gerais para aplicações em pesquisa biológica.
  • Ao solucionar qualquer procedimento laboratorial, é melhor começar com o passo final e trabalhar retroativamente, a fim de determinar o problema.
  • Ao manusear acrilamida e poliacrilamida, utilize luvas. A acrilamida é um reagente neurotóxico e pode ser absorvida através da pele. Poliacrilamida não é neurotóxica, no entanto, muitas vezes, contém acrilamida não polimerizada e pode ainda ser considerada tóxica.

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