Como ler um gel de agarose

Escrito por john brennan | Traduzido por luigi bahia
  • Compartilhar
  • Tweetar
  • Compartilhar
  • Pin
  • E-mail
Como ler um gel de agarose
A análise do gel vai depender dos resultados que você busca (Jason Reed/Digital Vision/Getty Images)

Ao correr amostras de DNA pelo gel de agarose e tirar uma foto, uma imagem pode ser gravada para mais tarde, de modo a analisar os resultados e interpretá-los. Os tipos de coisas que irá observar na imagem dependerão da natureza do seu experimento. Se você estiver fazendo comparação de impressões digitais de DNA, por exemplo, vai querer comparar o tamanho das bandas de DNA de duas amostras - do suspeito e de uma amostra da cena do crime, talvez. Se estiver trabalhando com plasmídeos de bactérias, pode ser necessário verificar se o o plasmídeo contém o primer exógeno. Consequentemente, a maneira como se interpreta o gel vai depender em parte do objetivo do seu experimento. No entanto, existem algumas regras gerais que você pode aprender para interpretar um gel de agarose com sucesso.

Nível de dificuldade:
Moderado

Outras pessoas estão lendo

O que você precisa?

  • Lápis
  • Papel
  • Programa de planilhas
  • Foto do seu gel
  • Régua

Lista completaMinimizar

Instruções

    O que fazer

  1. 1

    Começando de cima da imagem, meça a distância de cada banda na faixa padrão do seu gel (uma escadinha na imagem); ela contém pedaços do DNA cujo tamanho já é conhecido, então você deve saber o tamanho de cada um deles antes de começar sua experiência. Também meça a distância percorrida pelas bandas em cada uma das faixas standard.

  2. 2

    Divida a distância percorrida em direção ao fundo do gel por cada padrão e cada banda das amostras. O resultado é igual à 'mobilidade relativa'. Você pode usar o programa de planilha para fazer a aritmética para você para tornar esta etapa mais rápida.

  3. 3

    Digite a mobilidade relativa e o tamanho de cada padrão em seu programa de planilha; em seguida, use a ferramenta de gráficos do programa para criar um gráfico de dados com mobilidade relativa no eixo x e tamanho das bandas no eixo y.

  4. 4

    Insira uma linha no gráfico por meio de regressão não-linear. Consulte a seção de Ajuda do seu programa se você precisar aprender como fazer isso. No fim, você obterá uma equação que talvez seja similar à seguinte:

    y = (0.3) x^-2.5

    Note que o x aqui será a mobilidade relativa, enquanto y é o tamanho. Observe também que a sua equação pode ter números completamente diferentes para o expoente e coeficiente - esta equação é apenas fornecida como um exemplo hipotético.

  5. 5

    Pegue a mobilidade relativa das bandas de sua amostra e use-as como x para calcular o tamanho dos pedaços de DNA nas faixas de amostra.

    Suponha que a equação derivada pelo programa de planilha era de fato y = (0,3) x ^ -2,5, ea mobilidade relativa de uma banda de determinada amostra foi de 0,68. Substituindo 0.68 em sua equação, você encontra o seguinte:

    y = (0,3) (0,68) ^ -2.5

    Usando a sua calculadora, você eleva 0,68 à -2,5 e encontramos o seguinte:

    y = (0,3) (2,62)

    y = 0,786

    que seria então o tamanho estimado em quilobases de DNA de uma das bandas de sua amostra.

    PLasmídeos

  1. 1

    Repare que você pode ou não precisar usar as instruções nesta seção. Eletroforese em gel de agarose é frequentemente utilizada para confirmar que o plasmídeo contém uma determinada inserção. Se você não está trabalhando com plasmídeos, você pode pular esta seção. Se você estiver, no entanto, você pode achar úteis as seguintes instruções.

  2. 2

    Note que se você estiver trabalhando com plasmídeos sem cortes ou marcados ao mesmo tempo, você não pode estimar o tamanho das moléculas usando o procedimento da seção 1 acima. Isso porque plasmídeos marcados e inteiros migram a taxas diferentes do DNA linear.

  3. 3

    Compare o número de bandas em cada pista. Recorde que uma enzima de restrição corta DNA justamente nos sítios de restrição, e portanto, se a amostra foi tratada com DUAS enzimas de restrição, uma banda para o primer e uma para a parte restante do plasmídeo devem estar presentes.

    Isso porque a inserção será ladeada por dois sítios de restrição, cada um para uma enzima diferente, por isso os cortes em ambos os locais vão libertar o primer inserido no plasmídeo.

    Caso a amostra tenha apenas um corte em um ponto, o plasmídeo se mostrará na forma de DNA linear. Uma amostra cortada sem enzimas de restrição ou com uma única enzima de restrição, portanto, apresenta uma banda única, enquanto uma amostra cortada com duas enzimas de restrição que apresenta duas bandas.

  4. 4

    FIque de olho em bandas criadas pelo DNA plasmidial marcado. Um plasmídeo marcado tem um corte em apenas uma fita, de modo que migra mais lentamente do que um plasmídeo cortado. Plamídeos cortados por sua vez migram mais lentamente do que o DNA sem cortes.

  5. 5

    Estime o tamanho do primer utilizando o processo descrito na seção 1 e determine se ele corresponde às suas expectativas (que irão variar dependendo do experimento.)

Não perca

Filtro:
  • Geral
  • Artigos
  • Slides
  • Vídeos
Mostrar:
  • Mais relevantes
  • Mais lidos
  • Mais recentes

Nenhum artigo disponível

Nenhum slide disponível

Nenhum vídeo disponível