Protocolos de ELISA competitivo

Escrito por dana schafer | Traduzido por joão melo
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Protocolos de ELISA competitivo
Certifique-se de que todos os materiais de laboratório sejam esterilizados antes de realizar um teste de ELISA (pipettes in jar image by Lisa Eastman from Fotolia.com)

O teste de ELISA é um ensaio imunossorbente ligado a enzimas que utiliza anticorpos ou antígenos acoplados a uma enzima específica para ajudar a determinar a concentração de anticorpo ou antígeno. Se você está fazendo um teste de ELISA e não pode usar anticorpos específicos para obter seus resultados, sugere-se o ELISA competitivo, porque ele usa um antígeno conjugado a uma enzima, em vez do anticorpo, e um método de detecção diferente.

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Detecção utilizando mudanças de cor

Um protocolo comum para o ELISA competitivo é utilizar um anticorpo primário não marcado e purificado. O anticorpo reveste os poços de uma placa de microtitulação e é incubado com padrões desconhecidos. Um imunógeno é depois adicionado para se conjugar com o anticorpo primário, o qual se ligará aos sítios do anticorpo que ainda não estiverem ocupados. Um substrato é então utilizado para criar uma mudança de cor para mensuração da concentração da ligação.

Utilizando um leitor de ELISA para a medida

Use uma placa de poliestireno de micro-titulação e adicione o anticorpo primário em cada poço dela. Para atingir a ligação máxima, encha o poço com um micrograma do anticorpo. Incube a placa durante quatro horas à temperatura ambiente. Adicione o anticorpo de captura primária e lave os poços com PBS (Tampão fosfato salino). Incube as placas com tampão de bloqueio durante duas horas à temperatura ambiente. Lave os poços de novo duas vezes com PBS e adicione os padrões. Coloque a solução de antígeno-conjugado nos poços e incube outra vez durante duas horas. Lave a placa novamente com PBS quatro vezes. Adicione o substrato e meça as densidades no comprimento de onda específico usando um leitor de ELISA.

ELISA competitivo direto (citocromo c)

Para um ELISA competitivo direto, uma análise de diluição sérica para o antígeno que você está usando no experimento deve ser executada. A placa de micro-titulação, em seguida, é revestida com citocromo c e incubada durante a noite. A parte ELISA do ensaio é, então, realizada através da adição de reagente de bloqueio e anticorpo secundário. Os resultados da absorbância são lidos com um leitor de micro placas.

Incube o anticorpo primário em tubos

Nesse procedimento, o anticorpo primário é incubado em tubos de ensaio em que o antígeno de interesse liga-se a ele. As amostras são, então, adicionadas aos poços das placas de micro-titulação e incubadas. Os poços são então lavados para remover quaisquer complexos antígeno-anticorpo não ligados e, em seguida, é adicionada a solução de bloqueio para evitar que o segundo anticorpo se ligue aos poços. O anticorpo secundário é, então, lido em um leitor de placas para se obter os resultados.

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