Fatores que podem influenciar a transferência de proteínas no Western Blotting

Escrito por john brennan | Traduzido por kelly isayama
  • Compartilhar
  • Tweetar
  • Compartilhar
  • Pin
  • E-mail
Fatores que podem influenciar a transferência de proteínas no Western Blotting
O Western blotting é uma técnica popular nas pesquisas biomédicas modernas (Jupiterimages/Photos.com/Getty Images)

O Western Blotting é uma técnica relativamente direta de visualizar proteínas específicas do lisado celular, que é uma mistura de moléculas provenientes de células lisadas. Contudo, geralmente os iniciantes têm pouca sorte em fazer esse procedimento funcionar adequadamente. Uma fonte possível de erros envolve a transferência de proteínas para a membrana de nitrocelulose ou PVDF durante a eletroforese.

Outras pessoas estão lendo

Básico

Depois da eletroforese, o gel de poliacrilamida é removido do tanque de tampão e as proteínas que ele contém são transferidas para uma membrana de nirocelulose ou PVDF. O método mais comum para essa transferência é o semisseco. Nessa abordagem, um papel de filtro e a membrana são colocados em um ânodo, um eletrodo positivamente carregado. Outro pedaço de papel de filtro é colocado sobre o gel, seguido pelo cátodo. As proteínas já terão sido desnaturadas e serão revestidas com um composto chamado de dodecilsulfato de sódio, de maneira que todas elas fiquem com carga negativa. Consequentemente, a queda de voltagem entre os dois eletrodos puxa as proteínas para fora do gel, depositando-as na membrana. Vários fatores afetam a eficácia dessa transferência.

Corrente

Embora a voltagem e a corrente estejam relacionadas com a lei de Ohm (V = IR), a corrente é mais importante que a voltagem, nesse caso. Se ela for muito alta, poderá causar o superaquecimento. Além disso, um valor muito alto de corrente também pode fazer com que as proteínas melhores se movam tão rapidamente que elas perdem a chance de se ligarem à membrana. Escolha um tampão que tenha menor densidade de carga para evitar que a corrente aumente muito, sendo o Tris-Glycine um bom produto a ser utilizado. Além disso, não esqueça de retirar qualquer excesso de tampão que fique em torno do filtro de papel ou gel. Os acúmulos e poças de tampão podem conectar os eletrodos diretamente, criando um curto.

Membrana

É possível comprar membranas com diferentes tamanhos de poros. Além disso, o tamanho a ser escolhido dependerá do tamanho das proteínas que se quer estudar. O de 0,45 micrometros é uma escolha comum e, embora o peso molecular da proteína seja menor que 20 kiloDaltons, talvez seja necessária uma membrana com um poro ainda menor. Também escolha com cuidado o tipo de membrana que deseja usar. O PVDF é mais caro que a nitrocelulose, mas ele é menos frágil e pode-se sondá-lo repetidas vezes, ao passo que as membranas de nitrocelulose podem ser utilizadas, geralmente, uma vez só.

Substâncias químicas dos tampões

Incluir o metanol em seu tampão é importante, já que ele ajuda a remover o SDS das proteínas, para que elas possam se ligar à membrana. Contudo, adicionar muito metanol remove o SDS muito rapidamente, antes que as proteínas tenham saído do gel, o que pode levá-las a se amontoarem e ficarem presas no gel. Dependendo do tipo de experimento e do protocolo, 20% de metanol é uma concentração razoável, embora seja importante incluir uma baixa concentração de SDS também. Esse SDS adicional ajuda as proteínas a eluírem ou serem extraídas do gel.

Carga proteica e outros fatores

Conforme o metanol dissolve o SDS, as proteínas se tornam menos carregadas negativamente. Em algumas situações, isso pode se tornar um problema em potencial, já que as proteínas migram com uma velocidade menor conforme a carga se torna menos negativa. Se for observado que as proteínas não estão sendo propriamente transferidas por esse motivo, é possível tentar um tampão com pH maior, como o CAPSO (ácido sulfônico 3-N-ciclohexilamino-2-hidroxipropano), já que suas proteínas terão uma carga mais negativa em um pH mais alto. Outro fator a se considerar é o tempo de transferência. Proteínas maiores se movem mais devagar, então é preciso deixar que elas se movimentem por mais tempo em direção à membrana.

Não perca

Filtro:
  • Geral
  • Artigos
  • Slides
  • Vídeos
Mostrar:
  • Mais relevantes
  • Mais lidos
  • Mais recentes

Nenhum artigo disponível

Nenhum slide disponível

Nenhum vídeo disponível