×
Loading ...

Tutorial de desenho de primers

Atualizado em 21 fevereiro, 2017

Primers são pequenas sequências de DNA usadas em uma técnica biológica conhecida como reação em cadeia da polimerase (PCR). A técnica é usada por biólogos moleculares para amplificar sequências de genes para análises científicas mais sofisticadas, como sequenciamento de DNA, clonagem ou várias aplicações biotecnológicas. O desenho de primers é uma habilidade que deve ser dominada por qualquer um que deseje estudar genes e requer um entendimento sólido de Biologia e Genética. Embora as regras para o desenho de primers sejam relativamente simples, as complexidades da Genética, plataformas experimentais e sistemas computacionais resultaram em centenas de softwares avançados que podem ser usados para esse fim.

Instruções

O desenho de primers é uma habilidade e técnica utilizadas pelos biólogos para analisar sequências de DNA (DNA 10 image by chrisharvey from Fotolia.com)

    Tutorial de desenho de primers

  1. Obtenha a identidade do gene desejado no banco de dados Entrez Gene. Procure pela identidade da sequência referência (REFSEQ) do gene, simplesmente digitando o nome do gene no campo apropriado para busca. Em seguida, obtenha o código da identidade da sequência referência de cDNA do gene escolhido (p. ex., "NM_136342").

    Loading...
  2. Baixe a sequência "FASTA". Este é o conteúdo de nucleotídeos do gene representado por letras do alfabeto e é basicamente um arquivo de texto. Procure pelo símbolo de "maior do que" (>), que sinaliza o início da sequência do gene. Selecione, copie e cole a sequência inteira ou clique no botão "Download", para baixá-la para o seu computador.

  3. Obtenha a sequência do gene. Vá para o site do BLAT ou BLAST (genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat) e cole a sequência em formato FASTA na caixa de pesquisa. Clique em "Enviar".

  4. Use uma ferramenta profissional de desenho de primer, que incluem softwares como o gratuito Perlprimer ou outros mais sofisticados, comerciais, como VectorNTI e MacVector. No Perlprimer (perlprimer.sourceforge.net/), basta carregar a sequência no software e clicar em "Localizar primers".

  5. Confira os resultados. Você deverá ver primers normais e reversos ("pares de primers") com as posições numéricas na sequência, os comprimentos, a temperatura de desnaturação e a sequência de nucleotídeos completa deles. Verifique se os primers obtidos cumprem todas as regras de desenho, tal como pouca formação de dímeros de primers, a presença de um grampo de GC na extremidade três-linha (3') do primer e que pelo menos um deles abranja a fronteira íntron-éxon.

  6. Verifique os produtos gerados pelos primers. Execute uma PCR virtual (por exemplo, ePCR do NCBI) para verificar os tipos ou propriedades dos produtos de genes gerados pelos primers durante a PCR simulada.

Loading...

Referências

Recursos

Loading ...
Loading ...