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Tutorial de desenho de primers

Primers são pequenas sequências de DNA usadas em uma técnica biológica conhecida como reação em cadeia da polimerase (PCR). A técnica é usada por biólogos moleculares para amplificar sequências de genes para análises científicas mais sofisticadas, como sequenciamento de DNA, clonagem ou várias aplicações biotecnológicas. O desenho de primers é uma habilidade que deve ser dominada por qualquer um que deseje estudar genes e requer um entendimento sólido de Biologia e Genética. Embora as regras para o desenho de primers sejam relativamente simples, as complexidades da Genética, plataformas experimentais e sistemas computacionais resultaram em centenas de softwares avançados que podem ser usados para esse fim.

Instruções

O desenho de primers é uma habilidade e técnica utilizadas pelos biólogos para analisar sequências de DNA (DNA 10 image by chrisharvey from Fotolia.com)

    Tutorial de desenho de primers

  1. Obtenha a identidade do gene desejado no banco de dados Entrez Gene. Procure pela identidade da sequência referência (REFSEQ) do gene, simplesmente digitando o nome do gene no campo apropriado para busca. Em seguida, obtenha o código da identidade da sequência referência de cDNA do gene escolhido (p. ex., "NM_136342").

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  2. Baixe a sequência "FASTA". Este é o conteúdo de nucleotídeos do gene representado por letras do alfabeto e é basicamente um arquivo de texto. Procure pelo símbolo de "maior do que" (>), que sinaliza o início da sequência do gene. Selecione, copie e cole a sequência inteira ou clique no botão "Download", para baixá-la para o seu computador.

  3. Obtenha a sequência do gene. Vá para o site do BLAT ou BLAST (genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat) e cole a sequência em formato FASTA na caixa de pesquisa. Clique em "Enviar".

  4. Use uma ferramenta profissional de desenho de primer, que incluem softwares como o gratuito Perlprimer ou outros mais sofisticados, comerciais, como VectorNTI e MacVector. No Perlprimer (perlprimer.sourceforge.net/), basta carregar a sequência no software e clicar em "Localizar primers".

  5. Confira os resultados. Você deverá ver primers normais e reversos ("pares de primers") com as posições numéricas na sequência, os comprimentos, a temperatura de desnaturação e a sequência de nucleotídeos completa deles. Verifique se os primers obtidos cumprem todas as regras de desenho, tal como pouca formação de dímeros de primers, a presença de um grampo de GC na extremidade três-linha (3') do primer e que pelo menos um deles abranja a fronteira íntron-éxon.

  6. Verifique os produtos gerados pelos primers. Execute uma PCR virtual (por exemplo, ePCR do NCBI) para verificar os tipos ou propriedades dos produtos de genes gerados pelos primers durante a PCR simulada.

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Referências

Recursos

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