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Protocolos de ELISA competitivo

O teste de ELISA é um ensaio imunossorbente ligado a enzimas que utiliza anticorpos ou antígenos acoplados a uma enzima específica para ajudar a determinar a concentração de anticorpo ou antígeno. Se você está fazendo um teste de ELISA e não pode usar anticorpos específicos para obter seus resultados, sugere-se o ELISA competitivo, porque ele usa um antígeno conjugado a uma enzima, em vez do anticorpo, e um método de detecção diferente.

Certifique-se de que todos os materiais de laboratório sejam esterilizados antes de realizar um teste de ELISA (pipettes in jar image by Lisa Eastman from Fotolia.com)

Detecção utilizando mudanças de cor

Um protocolo comum para o ELISA competitivo é utilizar um anticorpo primário não marcado e purificado. O anticorpo reveste os poços de uma placa de microtitulação e é incubado com padrões desconhecidos. Um imunógeno é depois adicionado para se conjugar com o anticorpo primário, o qual se ligará aos sítios do anticorpo que ainda não estiverem ocupados. Um substrato é então utilizado para criar uma mudança de cor para mensuração da concentração da ligação.

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Utilizando um leitor de ELISA para a medida

Use uma placa de poliestireno de micro-titulação e adicione o anticorpo primário em cada poço dela. Para atingir a ligação máxima, encha o poço com um micrograma do anticorpo. Incube a placa durante quatro horas à temperatura ambiente. Adicione o anticorpo de captura primária e lave os poços com PBS (Tampão fosfato salino). Incube as placas com tampão de bloqueio durante duas horas à temperatura ambiente. Lave os poços de novo duas vezes com PBS e adicione os padrões. Coloque a solução de antígeno-conjugado nos poços e incube outra vez durante duas horas. Lave a placa novamente com PBS quatro vezes. Adicione o substrato e meça as densidades no comprimento de onda específico usando um leitor de ELISA.

ELISA competitivo direto (citocromo c)

Para um ELISA competitivo direto, uma análise de diluição sérica para o antígeno que você está usando no experimento deve ser executada. A placa de micro-titulação, em seguida, é revestida com citocromo c e incubada durante a noite. A parte ELISA do ensaio é, então, realizada através da adição de reagente de bloqueio e anticorpo secundário. Os resultados da absorbância são lidos com um leitor de micro placas.

Incube o anticorpo primário em tubos

Nesse procedimento, o anticorpo primário é incubado em tubos de ensaio em que o antígeno de interesse liga-se a ele. As amostras são, então, adicionadas aos poços das placas de micro-titulação e incubadas. Os poços são então lavados para remover quaisquer complexos antígeno-anticorpo não ligados e, em seguida, é adicionada a solução de bloqueio para evitar que o segundo anticorpo se ligue aos poços. O anticorpo secundário é, então, lido em um leitor de placas para se obter os resultados.

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Referências

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