Como otimizar a expressão das proteínas

Escrito por renda hawwa, ph.d. | Traduzido por ninah coracini
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Como otimizar a expressão das proteínas
Modificações nas condições de crescimento bacteriano podem melhorar a expressão da proteína (experiment image by martin schmid from Fotolia.com)

A expressão da proteína é o processo no qual a informação codificada em genes é traduzida em uma proteína. Em seus hospedeiros, muitas proteínas são produzidas em quantidades muito baixas para estudo em laboratório. Assim, os cientistas utilizam várias técnicas para superexpressá-las, a fim de produzir uma quantidade suficiente para a purificação e a caracterização. Os genes de interesse são inseridos em vetores de expressão (geralmente a partir do sistema de expressão pET), que são moléculas de DNA que podem replicar independentemente do DNA cromossômico. Esses vetores são então introduzidos em uma célula bacteriana, geralmente uma estirpe de Escherichia coli, para o crescimento e superexpressão. Se você tiver sorte, sua proteína irá superexpressar após o crescimento de uma simples noite em um crescimento médio, no entanto, esse processo muitas vezes exige solução de problemas, a fim de ganhar níveis de expressão ideais.

Nível de dificuldade:
Moderadamente desafiante

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O que você precisa?

  • Meio Luria-Bertani (LB)
  • Uma estirpe de bactérias para crescimento
  • Frascos ou tubos para manter culturas bacterianas
  • Espectrofotômetro
  • Pipetas
  • 1,5 ml de tubos Eppendorf
  • Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG)
  • Sacarose
  • Balão agitador com controle de temperatura
  • 1 por cento de n-octil-beta-D-thioglucopyranoside (OTG)
  • Centrífuga de mesa

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Instruções

    Otimização do tempo e da temperatura do crescimento

  1. 1

    Prepare duas ou mais culturas de cinco mililitros (ml) de sua proteína adicionando uma colônia de bactérias de uma placa de agar contendo a proteína em uma amostra de 5 ml de LB (meio Lúria Bertani) médio. Coloque as culturas para crescer durante a noite com agitação a 37 graus Celsius.

  2. 2

    Adicione 500 microlitros de cada cultura durante a noite em uma cultura separada contendo 50 ml de LB na manhã seguinte e coloque-as em um agitador a 37 graus Celsius.

  3. 3

    Permita que as culturas cresçam até que a absorvância a 600 nm atinja 0,6 (fase de crescimento exponencial). Meça a absorvância utilizando um espectrofotômetro inibida com meio LB. Quando a absorção atingir 0,6, permita que as culturas cresçam durante diferentes intervalos de tempo. Pontos de tempo sugeridos são de 3 horas, 6 horas, 12 horas, 18 horas e 24 horas.

  4. 4

    Verifique a absorvância depois de cada ponto de tempo e guarde as amostras de células de densidade iguais para cada cultura em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Como referência, uma absorvância de 1 a 600 nm corresponde tipicamente a uma densidade celular de cerca de 10^9 células/ml. Ajuste a quantidade de cada amostra que você guarda de acordo com a absorvância.

  5. 5

    Repita os passos acima mas, em vez de tentar pontos de tempo diferentes, tente temperaturas diferentes, colocando culturas de 50 ml em agitadores de diferentes temperaturas uma vez que a absorvância atinja 0,6. As temperaturas sugeridas são 37° Celsius, 30° Celsius, 21° Celsius ou 18° Celsius. Deixe crescer pelo tempo de sua escolha. Repita a coleta de amostras conforme descrito no Passo 4.

    Uso de indutores

  1. 1

    Prepare as culturas conforme descrição na Seção 1 e nos Passos 1 e 2.

  2. 2

    Adicione IPTG (Proteínas de indução e extração de bactérias) em uma concentração final de 1 milimolar a uma cultura logo que a absorvância a 600 nm atingir 0,6. O sistema de expressão pET é controlado pelo promotor lac, que é o local onde ocorre a ligação da RNA polimerase para iniciar a transcrição do gene. O IPTG desloca o repressor lac, uma proteína de ligação do DNA que se liga perto do promotor e impede a ligação da RNA polimerase. O deslocamento do repressor permite a ligação da RNA polimerase e a transcrição do gene.

  3. 3

    Adicione 5 por cento de sacarose a uma cultura, após a absorção atingir 0,6. A sacarose é uma fonte de carbono para o crescimento bacteriano.

  4. 4

    Adicione IPTG e sacarose para uma terceira cultura. Agora você vai ter pelo menos 4 culturas: uma com nada acrescentado para controle, uma com IPTG adicionadas, uma com sacarose adicionada e um tanto com IPTG e sacarose adicionadas.

  5. 5

    Permita que as culturas cresçam durante um tempo e a uma temperatura de sua escolha e colete as amostras conforme descrito na Seção 1, Passo 4.

    Análise dos níveis de expressão

  1. 1

    Centrifugue todas as amostras coletadas na velocidade máxima numa centrífuga de mesa. Descarte o líquido, deixando os pellets no fundo do tubo.

  2. 2

    Ressuspenda os pellets bacterianos em um por cento de OTG (octil-β-glucósido), um detergente que rompe as células.

  3. 3

    Faça uma análise em gel de SDS-PAGE em todas as amostras coletadas e monitore os níveis de expressão de sua proteína em cada amostra. A condição de crescimento que produzir a maior expressão é a que você deve utilizar para o crescimento, purificação e caracterização de proteínas em grande escala.

    Otimização adicional

  1. 1

    Varie os tipos de meios de cultura se a expressão ainda estiver difícil. Escolha alternativas que incluam meio SB (super broth) e meio TB (terrific broth).

  2. 2

    Varie as cepas das células bacterianas se a expressão ainda estiver difícil. Estirpes comuns de E. coli utilizadas para a expressão são chamadas de BL21 (DE3) e JM109 e são conhecidas por sobre-expressarem bem as proteínas.

  3. 3

    Teste combinações diferentes de tempo de crescimento, a temperatura e a indução, se necessário. Eles podem também ser testados em diferentes meios de cultura e estirpes bacterianas.

Dicas & Advertências

  • Pode ser necessário diluir cada amostra antes de tomar a absorvância se os valores estiverem demasiadamente elevados para o espectrofotômetro medir com precisão. Uma diluição de dez vezes é recomendada por 100 microlitros de sua cultura e a adição de 900 microlitros de meio LB. Certifique-se de que calculou o fator de diluição ao coletar as amostras.
  • Use sempre equipamentos de proteção individual quando trabalhar em um laboratório. Isso inclui um jaleco, óculos de proteção e luvas.

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