A finalidade do tampão na eletroforese

Escrito por john brennan | Traduzido por josé antonio arantes castro
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A finalidade do tampão na eletroforese
Para preparar gel de agarose misture o tampão com o pó de agarose e aqueça-os no microondas (Hemera Technologies/PhotoObjects.net/Getty Images)

As técnicas de eletroforeses separam as moléculas de DNA com base em seus tamanhos; técnicas semelhantes para proteínas podem separá-las com base no tamanho ou na carga. Em ambos os casos, o gel por meio do qual as moléculas migram é preparado utilizando uma solução tampão, um produto químico que atua para estabilizar o pH. O tampão cumpre vários papéis vitais na eletroforese.

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Corrente

O gel de eletroforese funciona aplicando-se uma corrente elétrica à placa de gel submergida no tampão. As moléculas de DNA são carregadas negativamente, e as proteínas podem ser carregadas negativamente desnaturando-as primeiro e depois tratando-as com dodecil sulfato de sódio (SDS). As proteínas ou moléculas de DNA migram do cátodo carregado negativamente para o ânodo carregado positivamente. A água, no entanto, é um veículo bastante pobre em corrente - só carrega corrente de modo eficaz quando se dissolve substâncias nela, já que íons carregados se movem em um campo elétrico. A solução tampão tem uma maior concentração de íons (maior força iônica), de maneira que consegue carregar muito mais corrente que a água pura.

Mudança de pH

O pH mede a concentração do íon de hidrogênio. A mudança de pH pode alterar a carga líquida das moléculas, como proteína ou DNA, causando uma migração mais demorada (ou mais rápida). Isso porque essas moléculas têm partes básicas que aceitam íons de hidrogênio (prótons) e muitas partes ácidas que podem doar prótons. Quando um ácido doa um próton, ele torna-se carregado negativamente; quando uma base aceita um próton, pelo contrário, ela fica carregada positivamente. À medida que a concentração de íons de hidrogênio na solução aumenta, proteínas e DNA tornam-se menos carregados negativamente (ou mais carregados positivamente). O pH no qual uma molécula, como a proteína, não tem carga é chamado de ponto isoelétrico. Tampões estabilizam o pH no gel em um nível em que o DNA irá estar carregado negativamente e irá migrar como desejado.

Gel de empilhamento

Tampões desempenham um papel ainda mais complexo em uma espécie de eletroforese chamada SDS-PAGE, ou dodecil sulfato de sódio, eletroforese em gel de poliacrilamida. Essa é uma das técnicas mais comuns para análise de proteína. Elas são desnaturadas por tratamento no calor e depois revestidas com dodecil sulfato de sódio, e só depois adicionadas ao gel, que geralmente corre verticalmente. O gel tem duas regiões, a de empilhamento (na parte superior) e a de correr por baixo. O gel de empilhamento é preparado com um tampão diferente de modo que o seu pH é mais baixo do que o do gel de correr, além disso, ele tem uma força iônica menor. Esses dois fatores causam o empilhamento da proteína, assim ela entra toda no gel de correr ao mesmo tempo. Esse efeito ajuda a garantir a separação das proteínas no gel de acordo com seu tamanho.

Tampão Eletroforese em gel de DNA

Os dois tampões mais comuns para eletroforese em gel de DNA são tris-acetato EDTA e tris-borato EDTA, onde o EDTA significa ácido etilenodiaminotetracético. Ele é importante porque serve como quelante dos íons de magnésio, retirando-os da solução. Esses íons são cofatores essenciais para enzimas chamadas DNAses que quebram o DNA, assim o EDTA no tampão funciona como uma precaução extra para prevenir quaisquer problemas com as DNAses.

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