Fontes de erro na eletroforese em gel

Escrito por sarahc | Traduzido por joão melo
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Fontes de erro na eletroforese em gel
A eletroforese em gel é mais comumente associada a sua aplicação ao DNA (DNA image by Allyson Ricketts from Fotolia.com)

A eletroforese em gel é usada em laboratórios para classificar e mensurar proteínas ou ácidos nucleicos. Após cuidadosa preparação, as amostras são colocadas em uma das extremidades do gel, uma corrente elétrica é aplicada e então elas correm para a extremidade positiva do gel. Como em qualquer procedimento científico, a possibilidade de erro humano e de outras fontes existe e deve ser levada em consideração na interpretação dos resultados.

Contaminação da amostra

Independente do que você esteja analisando, o primeiro passo para a obtenção de resultados precisos é uma amostra não contaminada. Adote medidas para evitar a contaminação durante o preparo usando luvas, apenas recipientes estéreis e trocando a ponteira após cada utilização. Também tome cuidado para não contaminar sua pipeta puxando a amostra além da ponteira.

Fontes de erro na eletroforese em gel
Luvas ajudarão a proteger você e suas amostras (latex gloves image by Wendy Lea Morgan from Fotolia.com)

Problemas do gel

Muitos erros decorrem de problemas com o gel. Primeiro, uma concentração incorreta de gel pode resultar em amostras que corram muito rapidamente ou nem corram. Certifique-se de estar usando uma concentração que seja medida corretamente e voltada para as dimensões gerais da amostra analisada. Por exemplo, quando se trata de uma amostra de DNA , um gel de 0,7% pode permitir testar eficazmente fragmentos entre 800 a 10 mil pares de bases de comprimento, enquanto que fragmentos menores requerem um maior percentual de gel.

O gel pode ser comprometido por outros meios. Antes de colocar suas amostras nele, certifique-se de que ele não tenha cortes ou bolhas. Mesmo uma pequena imperfeição pode afetar seus resultados. A preparação adequada é fundamental. Siga todas as instruções, despeje-o lentamente para evitar borbulhas e deixe-o esfriar completamente antes de aplicar suas amostras. A matriz molecular do próprio gel e a capacidade de sua amostra de movimentar-se através dessa matriz para a extremidade de carga positiva são o que demonstram o tamanho da amostra. A ruptura física ou até uma temperatura que seja muito radical afetarão essa matriz molecular e comprometerão a validade dos dados.

Finalmente, ao preparar o gel, deve-se colocar um pente para criar os poços onde se vai aplicar as amostras. Tome cuidado para que esse pente seja colocado corretamente nas inserções da bandeja, já que os poços demasiadamente profundos ou superficiais podem levar a erros. O pente não deve transpassar completamente o gel até o fundo da bandeja, mas deve criar poços com uma profundidade suficiente para colocar as amostras sem transbordar.

Fontes de erro na eletroforese em gel
Medidas cuidadosas e a concentração adequada de gel são a chave (cylinder image by Hubert from Fotolia.com)

Aplicação incorreta

Embora pareça bastante simples, aplicar amostras em pequenos poços no gel pode ser difícil. O mais importante é certificar-se de que você saiba o quanto colocar em cada poço. Muita amostra pode manchar ou parecer menor do que realmente é; já muito pouco pode ser impossível de se ver. Além disso, não perfure o gel durante o processo, pois isso pode causar problemas, assim como outras imperfeições.

Problemas de corrente elétrica

Um erro comum para os alunos novos na técnica de eletroforese é correr o gel ao contrário. Isso acontece quando as ligações positivas e negativas estão erradas. Você pode evitar esse erro, lembrando que a amostra vai sempre correr para o polo vermelho, por isso certifique-se de que o polo positivo esteja ligado no lado oposto dos poços do gel.

Há também problemas com a utilização incorreta de tensão. Uma tensão muito elevada pode fazer com que a amostra corra para além da outra extremidade do gel, enquanto que a muito baixa pode significar que a corrida vai demorar muito ou não ser suficiente para uma quantificação útil. O posicionamento incorreto da bandeja conforme a corrente ou suas interrupções podem fazer a amostra correr na diagonal ou de forma inconsistente, dificultando uma análise precisa.

Fontes de erro na eletroforese em gel
Evite voltagens muito altas (high voltage image by Soja Andrzej from Fotolia.com)

Erro de visualização

Se não puder ver os resultados, você obviamente vai ter dificuldade para interpretá-los. Uma amostra muito pequena pode ser difícil de visualizar. Problemas com os métodos de visualização também podem comprometer os resultados. Os métodos mais comuns usam corantes visíveis ou brometo de etídio (para visualização sob luz ultravioleta); eles devem ser adicionados ao gel, nas concentrações corretas, ou a visualização pode ser dificultada.

Medição variada

A medição variada é uma fonte amplamente aceita de erro na eletroforese em gel, e que os estudantes muitas vezes ignoram. Quando se mede o comprimento do gel que a amostra correu, sua análise será limitada em precisão, provavelmente em um milímetro. Quando sua medida parece estar entre milímetros, você não será capaz de especificá-la exatamente. Além disso, as bandas formadas pela eletroforese podem variar em espessura. Você mediu a parte superior ou inferior da banda em cada coluna? A consistência é importante, mas a medição da extremidade mais distante da faixa a partir do poço é mais comum. Tenha em mente que essa fonte de erro provavelmente também afetou sua quantidade de amostra e as concentrações de outros componentes em seu experimento.

Fontes de erro na eletroforese em gel
A precisão de suas medidas será afetada por seus instrumentos (steel ruler image by dwags from Fotolia.com)

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