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Como fazer géis de agarose

Escrito por palmer owyoung | Traduzido por joão melo
Como fazer géis de agarose

Como fazer géis de agarose

Comstock Images/Comstock/Getty Images

Géis de agarose são feitos por cientistas que trabalham em laboratórios de biologia molecular para estudar os fragmentos de DNA que são modificados durante o trabalho experimental. A técnica de fazer gel de agarose é uma habilidade de rotina fundamental que deve ser dominada por todos os pesquisadores, pois permite a visualização direta de diferentes tamanhos de DNA para verificação e projetos de clonagem de genes. Embora a preparação do gel não seja difícil, como todos os procedimentos laboratoriais, só deve ser tentada por um profissional treinado cientificamente por conta dos riscos biológicos envolvidos.

Nível de Dificuldade:
Moderadamente fácil

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O que você precisa?

  • Agarose em pó para eletroforese
  • Tampão TAE ou TBE
  • Solução de brometo de etídio
  • Base para o gel
  • Fita ou clipes da base para gel
  • Pentes para gel
  • Balanças e consumíveis
  • Etanol
  • Toalhas de laboratório
  • Equipamentos de proteção individual

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Instruções

    Preparação do gel de agarose

  1. 1

    Verifique se as bases para gel não têm rachaduras ou qualquer coisa que possa fazer com que a agarose quente vaze. Limpe as bandejas com álcool 70% e deixe secar completamente. A base tem duas extremidades abertas e duas extremidades fechadas. Em alguns formatos, grampos são fornecidos com elas a fim de fechar as extremidades, mas a maioria deve ser vedada por colocação de tiras de fita entre as partes abertas. Pressione a fita com força e seguramente, porque elas poderão se afastar do suporte e deixar a agarose quente vazar.

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    Com base no tamanho do fragmento de DNA a ser separado e analisado ​​em gel de agarose, determine o percentual adequado que será necessário. Por exemplo, a 1% (em peso-volume), o gel de agarose será eficaz para a análise de segmentos de DNA de 0,5 a 10 kb. Quanto maior o percentual (mais agarose), menores os fragmentos que podem ser separados. Os experimentos de rotina utilizam um intervalo de 0,5% a 2% de agarose. Para o gel de agarose 1%, pese 1 g de pó de agarose em uma capela química ou outro sistema de contenção. Transfira cuidadosamente para a área do laboratório de preparação do gel.

  3. 3

    Na área apropriada de preparação de gel, meça 100 ml de tampão de eletroforese. Ele deve estar à temperatura ambiente. Transfira o pó de agarose para um balão à prova de fogo e despeje o volume medido de tampão de eletroforese. Aqueça suavemente a mistura em um forno de microondas, mas não deixe ferver, porque a evaporação pode alterar o percentual de agarose presente. Assegure-se de que toda a agarose seja dissolvida, agite para misturá-la completamente, deixe-a esfriar ligeiramente e depois adicione 0,5 microgramas por mililitro de brometo de etídio. Não respire qualquer vapor, pois isso pode irritar os pulmões e tecidos da mucosa. Além disso, não aqueça a solução após o brometo de etídio ter sido adicionado. Agite novamente para misturar e, em seguida, enquanto a solução ainda estiver quente o suficiente para ser derramada, dispense-a na base preparada. Note que, se um grande volume de amostra ou uma pequena concentração de DNA estiver presente, um gel mais espesso pode ser feito. No entanto, os géis mais finos são mais fácil de analisar porque serão mais claramente fotografados.

  4. 4

    Insira os pentes no gel para criar ranhuras ou poços para a amostra a ser colocada. Deixe-o esfriar à temperatura ambiente durante várias horas ou no refrigerador durante alguns minutos. Nesse último caso, uma vez que o gel esteja pronto, deve ser observada a presença de cristais de agarose. Geralmente, eles desaparecem se o gel é deixado para esquentar à temperatura ambiente sobre uma bancada durante alguns minutos antes de usar. Remova cuidadosamente os pentes para não rasgar o gel ou quebrar os poços. O gel de agarose agora está pronto para usar. Se não for utilizado imediatamente, precisará ser embrulhado em celofane ou armazenado em um recipiente de plástico no refrigerador para impedir que seque ou derreta.

Dicas & Advertências

  • Os reagentes utilizados são possíveis carcinógenos e devem ser manuseados com cuidado e proteção adequada. Se um erro for cometido durante a preparação do gel, ele nunca deve ser reaquecido, mas eliminado e um novo gel preparado novamente.

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